详情内容

您现在所在的位置: 首页 > 详情内容

黄曲霉毒素M1与赭曲霉毒素A协同损伤肠道上皮细胞

发布日期:2018-09-15 14:52:01来源:

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所奶产品质量安全与风险评估创新团队在研究霉菌毒素联合作用后调控肠道完整性的机制取得新进展。研究成果《转录组与蛋白组联合分析表明黄曲霉毒素M1与赭曲霉毒素A混合作用于分化Caco-2细胞后对肠道上皮细胞完整性的损伤产生协同作用》已在国际知名学术期刊《Journal of Proteome Research2018年第17期上发表。该研究得到国家自然基金(31501399)、公益性行业(农业)科研专项项目(201403071)等项目支持,研究生高亚男和李松励博士为共同第一作者,郑楠博士为通讯作者。该研究结果的发现,为开展牛奶中霉菌毒素风险评估以及最大限量奠定了理论基础。

研究背景

通常来说,不仅空气和灰尘中会存在着霉菌毒素,动物性食物中(包括,肉,蛋,奶)都有可能受到霉菌毒素的污染。由于牛奶中营养丰富,牛奶及其奶制品在人类膳食结构中占据重要的地位。因此,被霉菌毒素污染的牛奶会对人体健康造成负面影响。目前,黄曲霉毒素M1(AFM1)是牛奶中唯一有规定最大限量的霉菌毒素。欧盟对AFM1的限量为0.05 μg/kg,中国及美国的限量为0.5 μg/kg。考虑到AFM1的细胞毒性、遗传毒性及致癌性,国际癌症研究机构(IARC)AFM12类致癌物更改为1类致癌物。由于黄曲霉毒素的毒性及潜在的致癌性,黄曲霉毒素暴露可能导致会一些人类疾病。牛奶中也存在其他多种霉菌毒素,例如,赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEA)和α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)。其中AFM1OTA的共存是牛奶中霉菌毒素污染的最常见的现象。2003年法国西北部的264份生鲜牛乳中,3份样品中检测出AFM1 (最高值为26 ng/L)3份样品中检测到OTA(5-8 ng/L)IARCOTA分类为2B类致癌物,对人类可能会造成致癌。尽管OTA在牛奶中没有最大限量,但是OTA暂定每周耐受量为100 ng/kg。因此,研究AFM1OTA共存后的对人类健康的毒理学作用具有重要意义。

实验方法

1.细胞培养与分化

23-31Caco-2细胞应用在本研究中,Caco-2细胞生长在5%CO295%湿度,37℃的培养环境下。培养基为DMEM,其中包含10%胎牛血清、4.5g/l L-谷氨酰胺,双抗(100 units/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)以及1%的非必需氨基酸。培养3天后,细胞汇合度达到80%,将细胞用胰酶消化下来,并且以40,000细胞/cm2的密度种到Transwell培养板中。连续培养21天,每两天换液一次,期间用Millicell-ERS电阻仪测定细胞间的跨膜电阻(TEER)值,当TEER值达到300 Ω.cm2时,即可证明Caco-2细胞分化完成。本次研究中,培养21天后的Caco-2细胞的TEER值为802±110 Ω.cm2.

2.细胞毒性试验


CCK-8实验用来测定在不同组合霉菌毒素的处理下细胞存活率。在处理之前,以6×104 细胞/ml的密度接种在96孔培养板中贴壁24 h。接着,加入不同浓度及组合的霉菌毒素处理细胞,AFM1 (0.000 05, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.25, 0.5, 1, 24 μg/mL) OTA (0.000 05, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.25, 0.5, 1, 24 μg/mL)48 h后,移除包含着霉菌毒素的培养基,再加入100 μl CCK-8试剂,在培养箱中孵育2 h最后,将96孔培养板放入酶标仪中,在450nm处测定吸光度。

3.TEER值测定


TEER值是测定细胞间完整性最方便的方法。在培养分化Caco-2细胞的Transwell板的上室和小室中分别加入单独和混合的AFM1OTA处理48h后,测定TEER值。

4.RNA测序,数据处理和基因注释


利用Trizol法提取总RNA;随后利用Agilent 2100检测RNA质量。RNA质量检测合格后,构建转录组文库,主要步骤为:mRNA分离及打断,cDNA双链合成并纯化,cDNA末端修复,加A,加接头,片段筛选,PCR文库富集和纯化,利用试剂盒进行文库质检。差异倍数≥2FDR0.05被认为是差异表达基因,对差异表达基因进行GOKEGG分析。


5.蛋白组学及数据处理


将细胞样品中加入裂解液,超声获得上清蛋白;随后,利用SDS-PAGE法检测蛋白质量;对检测合格的蛋白进行蛋白酶解及iTRAQ标记;进行高PH反相分离,以及低PH nano-HPLC-MS/MS分析,得到质谱原始数据raw文件。原始数据经过Mascot distiller转化为mgf格式。选择NCBInr人的物种库。将获得的mgf文件利用Mascot软件进行蛋白质鉴定,随后将所有样本中都能鉴定到的蛋白且Unique Spectra2的蛋白进行蛋白定量。依据蛋白丰度水平,当差异倍数达到1.2倍以上(>1.2,<0.83)且经统计检验其p-value<0.05,视为差异蛋白;并对差异蛋白进行GOKEGG分析。

6.Western blot试验


分化Caco-2细胞被裂解后,用上样缓冲液也其混合,电泳。PVDF膜利用5%脱脂牛奶室温下封闭1.5 h接下来,connexinFABP6Bax inhibitor 1β-actin一抗室温孵育3 h相对应的二抗室温孵育1 h灰度值利用ImageJ 2×软件分析。


7.蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析


蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)网络由与肠道完整性相关的差异表达基因和差异表达的蛋白质所构建。将具有大于0.7的组合分数(0:最低置信度; 1:最高置信度)的PPI相互作用用于进一步的网络分析。将所有差异表达的蛋白质定位到PPI网络上并通过Cytoscape可视化。


8.PKC基因干扰后肠道完整性的变化


使用OptiMEM siRNA转染培养基以及Lipofectin 2000 siRNA转染试剂转染Caco-2细胞。将分化的Caco-2细胞孵育在包含有siRNAsiRNA转染试剂的转染培养基与无血清细胞培养基的混合培养基中。 6小时后更换培养基,将细胞再培养24小时,然后如上所述测定TEER值。 然后收集细胞并裂解,利用western blotting 方法测定PKCconnexin蛋白的蛋白表达量。


1. 霉菌毒素对细胞存活率及TEER值的影响


2. 霉菌毒素处理分化Caco-2细胞后转录组分析。(AAFM1+OTA vs OTA处理组的差异基因数目。(B)与肠道上皮完整性相关的TOP20KEGG通路


3. 蛋白组分析与验证。(AAFM1+OTA vs OTA处理组中差异表达蛋白与肠道上皮完整性相关的KEGG通路。(B)蛋白组学验证


4. 基于转录组-蛋白组联合分析的一些涉及肠上皮完整性的生物学途径的总结


5. PKC蛋白功能验证。(APKC基因干扰后,PKC蛋白和connexin蛋白表达量的变化。(BWestern blot条带定量分析。(CPKC基因干扰后,TEER值变化


结果与讨论

1展示的是分化Caco-2细胞暴露于不同浓度下单独及混合的AFM1OTA后细胞存活率及TEER值的变化。处理48 h后,单独不同浓度AFM1OTA的处理没有引起细胞存活率的显著变化(p>0.05)。然而,单独OTA(4 μg/ml)和混合AFM1(4 μg/ml)OTA(4 μg/ml)处理使分化Caco-2细胞的TEER值显著(p<0.05)低于对照组。并且,混合毒素处理组的TEER值低于单独毒素处理组。

2展示的是霉菌毒素处理分化Caco-2细胞后转录组分析。如图所示,相比于OTA单独处理组,AFM1+OTA混合处理组共有2660个差异表达基因(DEG,其中2631个基因下调和29个基因上调。与肠道完整性相关的途径,例如粘附连接,粘着斑和肌动蛋白细胞骨架途径的调节,均由AFM1+OTA处理组中下调基因所富集。

3展示的是霉菌毒素处理分化Caco-2细胞后蛋白组分析与验证。与肠上皮完整性相关的通路是由AFM1+OTA处理中下调的蛋白质富集,例如间隙连接,TRP通道的炎性介质调节和钙信号传导途径。 为了验证蛋白组学的准确性,通过Western blotting方法验证差异表达的蛋白质,这些蛋白质的相对表达与我们的蛋白质组数据一致。

4展示的是基于转录组-蛋白组联合分析的一些涉及肠上皮完整性的生物学途径的总结。与单独的OTA相比,AFM1OTA处理组合表明肌球蛋白轻链激酶(MLCK),丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),PKCiQGAPGSK-3β和一些肌动蛋白调节因子可能是影响肠道上皮完整性的主要因素。

5展示的是PKC蛋白在肠道上皮完整性方面的功能验证。相比于空白对照组和空载体处理对照组,PKC siRNA组中的连接蛋白connexin蛋白表达量和TEER值均有显著差异(p <0.05),表明PKC在对肠道上皮完整性具有重要影响。

结论与展望

以上细胞试验结果有力阐明了混合霉菌毒素AFM1OTA损伤肠道上皮完整性并呈现协同作用的潜在机制。牛奶中的霉菌毒素可能会对人体肠道造成一定的负面影响,从而引发肠道相关疾病。因此,进一步研究霉菌毒素在体内生理吸收、代谢、转化规律十分必要。建议在食品中、尤其是婴幼儿配方食品中优化相关的霉菌毒素,尤其是OTA安全限量标准。(通讯员:高亚男郑楠)

Y.N. Gao, S.L. Li, X.Y. Bao, C.C. Luo, H.G. Yang, J.Q. Wang, S.G. Zhao, N. Zheng*.Transcriptional and Proteomic Analysis Revealed a Synergistic Effect of Aflatoxin M1 and Ochratoxin A Mycotoxins on the Intestinal Epithelial Integrity of Differentiated Human Caco-2 Cells. Journal of Proteome Research. 2018, 17, 3128-3142.

相关链接:https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jproteome.8b00241